近日，上海细胞治疗集团与上海大学团队合作，共同在Nature旗下的权威期刊Scientific Reports上（IF=3.8），发表了一种通过电穿孔技术从冷冻保存的外周血单个核细胞（PBMCs）来制备高质量CAR-T的新技术可行性结果“Comparative analysis and process optimization for manufacturing CAR-T using the PiggyBac system derived from cryopreserved versus fresh PBMCs” (DOI:10.1038/s41598-025-89686-7)。研究证实，借助电穿孔技术从冷冻PBMCs制备高质量CAR-T具有可行性。通过对工艺的优化，CAR-T细胞的扩增效率得到显著提升，抗肿瘤活性也明显增强。该研究为细胞存储与细胞治疗联合提供了实验基础，有望为CAR-T治疗的普及提供全新的模式，推动细胞治疗的发展。

CAR-T疗法的疗效在很大程度上取决于T细胞的质量，因此，患者免疫细胞的质量与治疗的疗效密切相关。为了保证CAR-T的治疗效果，在健康阶段提取PBMC并通过冷冻储存以备后用将是一种有效的方法。然而，冻存的PBMCs是否能维持新鲜状态的特性？冻存PBMC能否实现电穿孔技术制备CAR-T及CAR-T活性是否收到影响目前还不清楚；通过对比研究和制备技术的优化对于推动细胞治疗领域的进一步发展非常关键。

文章研究了不同冷冻保存时间：3个月、6个月、12个月和2年对PBMCs活率的影响，并且和新鲜PBMCs分别制备了mesoCAR-T以确认其功能情况。其中转导采用的是PiggyBac 转座子电穿孔技术，该技术可以突破病毒制备导致高成本的限制，还具有可转导较大DNA片段的能力等优势。

冻存与新鲜PBMCs细胞活力和表型比较实验工作流程

研究中，通过对比冷冻与新鲜PBMCs发现，冷冻3个月至2年的PBMCs活率依旧可保持稳定（约90%）。冷冻后NK细胞和B细胞比例虽然有所下降，但CAR-T主要来源的T细胞比例未显著变化。而且T细胞分化状态，比如初始T细胞Tn、中央记忆T细胞Tcm也未因冷冻而发生改变。重要的是，长期冻存也不影响CAR-T的功能：其扩增能力、表型、耗竭标志物都和新鲜来源的PBMCs相似。并且对SKOV-3细胞（人卵巢癌细胞系）的杀伤效率24小时内能够达91-100%，另外细胞因子（如IFN-γ、IL-6）分泌水平无明显差异。表明冷冻保存PBMCs活率稳定，能够解决患者因细胞状态差和制备延迟的问题。

PiggyBac转座子电穿孔制备mesoCAR-T的关键在于工艺，而非冷冻：研究发现虽然mesoCAR-T能成功地从冷冻2年的PBMC中制备，但在电穿孔后第3天，细胞活率就发生显著下降。该研究通过对CAR-T制备技术的优化，包括降低电穿孔密度和培养密度，最终探索出一个可以实现更好的mesoCAR-T扩增的最优的工艺【电穿孔密度（1×108 cells/mL）和培养密度（1×10⁶ cells/mL）】。在这个工艺下，72小时内平均扩增增加67.23%，而不会影响活率。优化后mesoCAR-T对于肿瘤细胞的杀伤速度明显加快，4小时内即可达到80%肿瘤细胞清除率，且安全性未受影响。

这项研究采用冷冻与新鲜PBMCs对比发现冷冻3个月至2年的PBMCs活率保持稳定，并通过优化具有容量较大、安全高效等优势的PiggyBac电穿孔CAR-T制备技术使扩增效率提升，杀伤速度加快，4小时内即可达到80%肿瘤细胞清除率。因此该研究不仅验证了基于电穿孔的方法从冷冻保存的PBMCs中生成高质量的CAR-T的可行性，而且有可能为未来的CAR-T生产建立新的基准，从而提高这些疗法对更广泛患者群体的可及性和可用性。